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            關于雙熒光素酶報告系統的那些百問百答

            發布日期: 2019-12-24
            瀏覽人氣: 1092
               雙熒光素酶報告系統是該試劑盒先對轉染后的細胞進行裂解,然后以熒光素為底物檢測螢火蟲熒光素酶的活性,之后在淬滅該熒光反應的同時,以腔腸素為底物檢測海腎熒光素酶報告基因的活性;具有檢測信號強、線性范圍廣、無內源活性干擾等特點。
              1:雙熒光素酶報告基因適反應溫度?
              A:室溫(20-22℃)。反應時各個組分(細胞裂解產物,底物工作液等)都需要調整到室溫。此兩種熒光素酶的反應速率是受溫度影響的,為了保證實驗的一致性,我們推薦此兩種工作液在檢測時都孵育至室溫。
              2:雙熒光素酶報告基因載體該如何選擇?
              A:1)螢火蟲熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4或者自己構建的載體
              2)海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4載體或者自己構建相應的載體。建議海腎載體不使用強啟動子(如SV40、CMV),而選用中等強度的啟動子(如TK)。
              3:檢測的熒光數值很低怎么辦?
              A:檢測的熒光數值很低說明細胞裂解液中的熒光素酶含量很低。通常解決辦法為
              1)轉染的質粒采用細胞轉染級別的質粒抽提試劑盒抽提。
              2)優化轉染條件,盡可能的提高轉染效率。
              3)增加實驗的細胞量,并且裂解細胞時,適當減少細胞裂解液的量。
              4:進行檢測的過程中,熒光信號值太高該如何進行調整?
              A:1)在轉染實驗后,減少細胞的孵育時間。
              2)降低熒光信號采集時間。
              3)進行樣品的稀釋。
              5:螢火蟲熒光素酶讀值和海腎熒光素酶讀值的比例多少時比較合適?
              A:盡量保證對照組的螢火蟲熒光素酶的讀值和海腎熒光素酶的讀值接近,或者海腎熒光素酶的讀值比螢火蟲熒光素酶的讀值稍高。對于具體的實驗過程中,由于螢火蟲熒光素酶質粒和海腎熒光素酶的質粒抽提的質量不一致,待檢測目的調控元件的調控能力的不同等原因,一次實驗很難達到一個比較好的實驗結果,因此對于此實驗,我們推薦預實驗優化螢火蟲熒光素酶質粒和海腎熒光素酶質粒的共轉染量。
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